本文节选至“Moving fromthe bench towards a large scale, industrial platform process for theadeno-associated viral vector purification”。该综述总结了现今AAV病毒载体的大规模纯化所使用的可放大的纯化技术。本文简单描述一下该文中介绍的工艺方法和技术手段。
一个典型的可放大的AAV纯化平台主要包括以下步骤：收获和澄清步骤；捕获纯化步骤；精细纯化步骤；病毒去除步骤和超滤浓缩步骤。
细胞裂解：物理性方法：反复冻融，高压均质和超声。工艺放大需要特定的仪器设备，不常使用。化学性方法：去污剂（包括Triton X-100和Tween 20），高渗溶液。有报道，pH4.2的柠檬酸溶液也可以用于细胞的裂解，并有利于AAV的释放。酶处理步骤：Benzonase（高浓度的盐会抑制其活性），盐激活的核酸酶（SAN-HQ，ArcticZymes）。澄清步骤：深层过滤，一些带电荷性质的深层过滤膜（3M）有助于蛋白类杂质的去除。亲和层析：最常用的是来自羊驼单域抗体片段制备的亲和层析介质。不过，不同供应商提供的产品对不同类型的血清型亲和力不同。
离子交换和疏水层析也可以用于AAV病毒的捕获纯化步骤。其中CIMmultus OH是一种整体柱类型的疏水作用层析，采用磷酸钾作为离液盐使用。
AAV病毒的精细纯化主要目的是去除痕量的工艺相关杂质（比如HCP，HCD）以及产品相关杂质（比如AAV聚集体和空壳AAV病毒），其中空壳AAV的去除是重点，也是难点。AAV病毒纯化常用的介质有传统的柱床形式层析，以及对于其更有优势的膜层析和整体柱层析。相对于传统的柱层析，膜层析和整体柱具有更大的孔径，更优的传质，因此流速更高，结合和分离能力更优。空壳AAV病毒的去除，现在主要还是依赖于层析手段。阴离子交换层析是使用最多的方法，比如POROS HQ和Q Sepharose XL。膜层析（比如Mustang Q）和整体柱层析（CIMmultus QA）也有报道可以实现很好的空壳AAV病毒的去除。
去除AAV病毒载体生产中使用的辅助病毒是安全性考虑的要点。可使用的方法主要包括：热处理灭活；去污剂灭活；低pH病毒灭活，以及层析分离去除和纳滤。超滤浓缩主要采用切向流过滤（TFF）的方法。100-300kDa，AAV病毒颗粒的分子量可超过600kDa。超滤浓缩步骤最重要的是防止病毒的聚集，加入一些添加剂，比如甘油，Tween80或者PF68，可在一定程度上抑制病毒的聚集，有时候需要调节缓冲液pH值＜4.5或者＞10。参考文献
Benjamin Adams | Hanne Bak | Andrew D. Tustian Moving from the bench towards a large scale, industrialplatform process for adeno‐associated viral vector purification Biotechnology and Bioengineering. 2020;117:3199–3211.
本文来源：公众号星辰纯视界 ，作者星辰君。
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